1. Regenerasi Khamir
Biakan murni S. cerevisiae diremajakan pada agar miring (media YGA) yang telah
disterilisasi pada suhu 121 oC
dan tekanan 1 atm selama 15 menit, selanjutnya
diinkubasi pada suhu 30 oC selama 48 jam. Saccharomyces
cerevisiae pada media YGA ini menjadi stok kultur yang diregenerasi pada media YGA yang
baru sebelum digunakan.
2. Pembiakan untuk Memperoleh Biomassa S. cerevisiae
Sebanyak satu ose Saccharomyces
cerevisiae dari YGA miring diinokulasi pada 10 mL media
kompleks dan diinkubasi pada suhu 30
oC selam 20 jam dengan dishaker 100 rpm. Setelah
20 jam, starter ini di
pindahkan ke 90 mL media
kompleks dan diinkubasi pada kondisi yang sama.
100 mL starter ini selanjutnya di pindahkan lagi ke dalam 900 mL media kompleks dan diinkubasi pada suhu 30 oC
dan dishaker 100 rpm.
Selama
inkubasi, pertambahan biomassa diamati
dan dihentikan pada saat pertumbuhan
S. cerevisiae memasuki pertengahan
fase log
(± 20
jam) dengan cara disimpan dalam lemari es pada suhu
4-10 oC. (Hadioetomo, 1983)
Pada saat sel akan digunakan, sejumlah volume tertentu cairan stok biomassa ini disentrifuga pada 6000
rpm
selama 30 menit untuk memisahkan sel dari media cair. Supernatan dipisahkan dari
sel basah dengan
cara dekantasi . Sel basah yang diperoleh selanjutnya akan digunakan untuk fermentasi dalam keadaan bebas
dan
teramobil. (Goksungur,
Y. dan Zorlu, N, 2001)
3. Optimasi Konsentrasi
Agar batang
Sel yang akan diamobil diambil dari 80
mL cairan stok biomassa dengan cara yang telah dijelaskan sebelumnya. Sel basah yang diperoleh ditambah aquades steril sampai 8 mL dan dibagi empat, masing-masing 2 mL.
Agar batang sebanyak
0,1; 0,2; 0,3 dan
0,4 g masing-masing
dilarutkan dalam aquades yang sudah mendidih sambil di stirer sampai larut dan ditepatkan volumenya sampai 8 mL. Larutan
tersebut diturunkan suhunya sampai kira-kira 40 oC dan masing-masing dicampur dengan 2
mL suspensi sel basah yang telah disiapkan sebelumnya dalam cawan petri, sehingga diperoleh larutan agar batang yang berkonsentrasi 1, 2, 3 dan
4 % (b/v). Semua
larutan diaduk hingga homogen dan
dibiarkan selama satu malam dalam lemari es. Gel yang terbentuk dipotong 5 x 5 mm dan dicuci dengan larutan NaCl 0,85 % (b/v) untuk menghilangkan
sel yang
tidak terperangkap.
Jumlah sel yang lepas ditentukan dengan metode
cawan tuang. Setiap sel amobil kemudian digunakan dalam
fermentasi menggunakan 100 mL media kompleks selama 48 jam pada suhu 30 oC
. Selanjutnya semua cairan fermentasi disentrifuga dan supernatannya
didestilasi. Kadar
etanol dalam masing-masing destilat
diukur dengan kromatogafi gas. Konsentrasi
agar
batang optimal adalah yang menghasilkan etanol terbanyak. Sel yang teramobil dalam
agar batang diketahui dengan
cara
mengurangi
jumlah
sel
yang digunakan dalam amobilisasi dengan jumlah sel yang lepas.
4. Optimasi pH
Pengaruh pH
terhadap kadar etanol yang dihasilkan dari fermentasi dengan sel
amobil dilakukan pada 5 x 100 mL media kompleks dengan variasi pH
3,6;
3,9; 4,2; 4,5 dan 4,8. Sel amobil yang digunakan dibuat dengan konsentrasi agar batang optimal yang telah diketahui
sebelumnya dengan cara dan jumlah
yang sama (gel dari 10 mL larutan agar batang 2
% untuk 100 mL media
fermentasi). pH
awal
media fermentasi diatur menggunakan
HCl 10 %. Fermentasi dilakukan selama 48 jam pada suhu
30 oC. pH optimal media fermentasi adalah yang
memberikan kadar etanol terbesar.
5. Optimasi Konsentrasi Glukosa
Konsentrasi glukosa
dalam 100 mL
media kompleks (dengan pH optimal)
dibuat bervariasi (8; 10; 15; 20; dan 25 %). Sel amobil dengan konsentrasi agar batang dan pH
optimal digunakan dalam fermentasi selama 48 jam pada suhu 30 oC. Selanjutnya semua cairan fermentasi disentrifuga dan supernatannya
didestilasi. Kadar etanol masing-masing destilat diukur dengan kromatogafi gas. Konsentrasi glukosa
optimal
adalah konsentrasi glukosa pada media yang memberikan kadar etanol terbesar.
6. Fermentasi dengan Sel Bebas untuk
Memperoleh Pola Konsumsi Glukosa dan Produksi Etanol
80 mL cairan stok biomassa disentrifuga pada 6000 rpm selama 30 menit. Supernatannya didekantasi dan sel bebas yang diperoleh digunakan dalam fermentasi
menggunakan 800 mL media kompleks optimal (dengan pH
dan konsentrasi glukosa
optimal)
pada suhu
30
oC. Cairan fermentasi
sebanyak
105 mL diambil sebagai
sampel setiap 6-12 jam. Sampel disentrifuga selama 30
menit pada 6000 rpm dan
supernatannya didekantasi. 1 mL supernatan sampel digunakan
untuk analisis kadar
glukosa dengan metode Smogy-Nelson
dan 100 mL didestilasi dan dianalisis kadar etanolnya.
7. Fermentasi dengan Sel Amobil untuk
Memperoleh Pola Konsumsi Glukosa dan Produksi Etanol
80
mL cairan stok biomassa disentrifuga
pada 6000 rpm selama 30 menit.
Supernatannya didekantasi dan sel
bebas yang diperoleh diamobilisasi
dalam agar batang 2% dengan cara
yang telah dijelaskan sebelumnya. Semua sel amobil selanjutnya digunakan dalam fermentasi menggunakan 800 mL media
kompleks pada kondisi optimal dan
suhu 30 oC. Cairan fermentasi
sebanyak 105 mL
diambil
sebagai sampel setiap 6-12 jam. Sampel disentrifuga selama 30 menit pada 6000 rpm dan supernatannya didekantasi. 1 mL supernatan
sampel digunakan untuk
analisis
kadar glukosa dengan metode Smogy-Nelson dan 100 mL didestilasi
dan dianalisis kadar etanolnya.
8. Uji Perulangan
Untuk
mengetahui pengaruh perulangan penggunaan sel amobil
terhadap
kadar
etanol
yang dihasilkan, sel amobil (agar batang 2 %) digunakan berulang dalam fermentasi menggunakan media
kompleks pada kondisi optimal dan suhu 30
oC
selama waktu optimal (dilihat dari kurva
etanol sebagai
fungsi waktu yang telah diperoleh sebelumnya). Setelah
fermentasi pertama selesai, sel amobil
dipisahkan dengan cara
disaring dan langsung
dimasukkan ke dalam media
fermentasi
yang
baru untuk fermentasi berikutnya dengan kondisi
yang sama. Perlakuan ini diulangi sebanyak lima kali dan dianalisis kadar
etanol yang dihasilkan pada setiap perulangan fermentasi.
9. Uji Durabilitas Sel Amobil terhadap
Penyimpanan
Untuk mengetahui durabilitas sel
amobil terhadap waktu penyimpanan, empat cawan petri sel
amobil (setiap cawan
berisi sel amobil
dalam
10 mL agar batang 2 %) digunakan dalam fermentasi setelah disimpan masing-masing
selama 0,
3, 6 dan
9 hari. Penyimpanan
dilakukan tanpa media apapun dalam lemari es dengan suhu 4-10 oC. Fermentasi dilakukan
menggunakan media kompleks optimal
selama waktu optimal pada suhu 30 oC. Setiap
hasil
fermentasi dianalisis kadar etanolnya untuk mengetahui durabilitas sel amobil dalam
menghasilkan etanol setelah disimpan selama waktu tertentu.
10
Metode Analitik
Untuk menganalisis kadar etanol, sampel cairan
fermentasi disentrifuga pada 6000
rpm selama 30 menit. Supernatannya didestilasi pada suhu 78–80 oC menggunakan peralatan
destilasi vigreux. Kadar etanol
dalam destilat ditentukan dengan kromatografi gas
Shimadzu GC-14B (kolom CBP-10 medially polar, detektor FID, integrator Shimadzu C-R6A Chromatopac).
Temperatur oven dan kolom diatur pada 180
oC dan temperatur injektor dibuat pada 250 oC. Konsentrasi glukosa ditentukan dengan
metode Smogy-Nelson. Jumlah
sel
ditentukan dengan
metode turbidimetri menggunakan spektronik
20D pada 620 nm dan cawan tuang.
itulah salah satu prosedur kerja yang dapat digunakan :)
Tidak ada komentar:
Posting Komentar