OPTIMASI PROSES HIDROLISIS KIMIAWI DAN ENZIMATIS TANDAN KOSONG KELAPA SAWIT MENJADI GLUKOSA UNTUK PRODUKSI ETANOL

METODE  KERJA

PEMBUATAN MEDIA

Media  PDA dibuat dengan cara melarutkan 39 g PDA (Difco) ke dalam 1 L akuades lalu disterisasi, kemudian dituang ke dalam cawan petri yang sudah steril. Media yang sudah dingin siap untuk ditanam inokulum (Fassatiova, 1986).

Media  Hans  dibuat  dengan  cara  melarutkan  :  0,5  gram  K2HPO4,  0,5  gram KH2 PO4, 1 gram (NH4)2  SO4, 0,1 gram Ca Cl2, 6 gram Na Cl, 0,1 gram yeast ekstrak,  10  gram  selulosa  dan  20  gram  agar  ke  dalam  1  L  akuades  lalu disterilisasi, kemudian dituang ke dalam cawan petri yang sudah steril. Media yang sudah dingin siap untuk ditanam inokulum (Rao, 1982).

Media  YEDP  dibuat dengan cara melarutkan 10 gram yeast ekstrak, 20 gram pepton, 20 gram glukosa, 18 gram agar ke dalam 1 L akuades lalu disterilisasi, kemudian dituang ke dalam cawan petri yang sudah steril. Media yang sudah dingin siap untuk ditanam inokulum (Granot et al. 2003)

Media  PDB dibuat dengan cara sebagai berikut. Kentang dikupas, dibersihkan, dicacah dan ditimbang sebanyak 200 g, dicampur dengan                                                                                                1 L air direbus hingga mendidih.  Setelah  mendidih  air  rebusan kentang disaring  dan dimasukkan ke dalam erlenmeyer 1 liter dicampur dengan 20 g sukrosa teknis dan diaduk hingga larut,  kemudian  dibagi ke  dalam erlenmeyer  250  mL,  lalu  disteril,  kemudian didinginkan. Media yang sudah dingin siap untuk ditanam (Fassatiova, 1986)

Media Hans Cair dibuat dengan cara melarutkan komposisi bahan kimia                           media Hans padat tanpa agar, lalu disterilisasi, kemudian didinginkan. Media cair yang sudah dingin siap untuk ditanam (Rao, 1982).

Media  YEDP  Cair   Dibuat  dengan  cara  melarutkan  komposisi  bahan  kimia media YEDP padat tetapi tanpa agar, lalu disterilisasi, kemudian didinginkan. Media yang sudah dingin siap untuk ditanam (Granot et al. 2003).

Media  Fermentasi untuk  hidrolisis Enzimatis  dibuat dengan cara melarutkan Media nutrient steril sebanyak 50 mL yang terdiri dari (NH4)2HPO4 1 g/L, MgSO4.7H2O 0,05 g/L dan yeast ekstrak 2 g/L dengan pH Media 5, (Ito, et al.

2003).

PEMELIHARAAN STOK KULTUR

JPP Isolat A-1 (Omphalina) dinokulasikan dengan menggunakan jarum inkubasi ke dalam cawan petri yang berisi media PDA steril, kemudian diinkubasikan pada suhu kamar selama satu minggu hingga dihasilkan miselium berwarna putih (Fassatiova, 1986).

Pemeliharaan stok kultur untuk Trichoderma sp yaitu dengan cara menginokulasikan sebanyak satu ujung jarum spora jamur ke dalam media PDA steril dan diinkubasi pada suhu kamar selama 1 minggu sebagai stok kultur. Fungi tumbuh dalam waktu tiga hari dengan ditandai adanya warna hijau pada PDA (Fassatiova, 1982).

Untuk bakteri selulolitik diinokulasikan sebanyak 1 ose isolat bakteri selulolitik ke dalam media Hans padat steril dan diinkubasi pada suhu kamar 1 – 2 hari sebagai stok kultur (Rao, 1989).

Sedang       pada     S.     cerevisiae        diinokulasikan         sebanyak       1     ose      isolat S. cerevisiae ke dalam media YEDP dan di inkubasi pada suhu kamar 1 sampai 2 hari sebagai stok kultur (Granot et al. 2003).

PEMELIHARAAN KULTUR KERJA

Kultur  JPP  Omphalina sp dari cawan petri (stok kultur) dipindahkan ke dalam botol jam yang berisi media PDB steril dan diinkubasikan dalam suhu kamar selama 3 hari sambil dikocok dengan kecepatan 120 rpm sebagai stok kerja untuk proses delignifikasi (Fassatiova, 1986).

Untuk Trichoderma sp, isolat  Trichoderma dari cawan petri (stok kultur) sebanyak satu ujung jarum dipindahkan ke dalam botol jam yang berisi media PDB steril dan diinkubasikan dalam suhu ruang selama 3 hari sambil dikocok dengan kecepatan 120 rpm sebagai stok kerja untuk proses hidrolisis secara enzimatis (Fassatiova, 1986).

Sedang kultur bakteri selulolitik dari cawan petri (stok kultur) sebanyak 1 ose dipindahkan ke dalam erlenmeyer 100 mL yang berisi media Hans cair dan di inkubasi pada suhu kamar selama 3 hari, sambil dikocok dengan kecepatan 120 rpm sebagai stok kerja untuk proses hidrolisis secara enzimatis (Rao, 1982).

Sedang pada isolat Saccharomyces cerevisiae, sebanyak 2 ose isolat per 75 ml media YEDP cair steril diinokulasi ke dalam botol jar di inkubasi pada suhu kamar selama 3 hari, sambil dikocok dengan kecepatan 120 rpm   sebagai stok kerja untuk proses fermentasi (Granot et al. 2003).

PROSES DELIGNIFIKASI

Proses Delignifikasi oleh Jamur Pelapuk  Putih  Omphalina sp (Akhtar  et al,

1997)

TKKS yang telah dicacah direndam air satu malam,  lalu ditiriskan, kemudian dimasukkan ke dalam plastik tahan panas masing-masing sebanyak 240 gram per bungkus dan disterilisasi (tiga kali ulangan). Setelah dingin  sebanyak 100  ml inokulum JPP Omphalina sp dari medium PDB (stok kerja) diinokulasikan ke dalam TKKS tersebut dan diinkubasikan selama 20 hari dalam suhu ruang (27OC) sampai miselium JPP Isolat A-1 omphalina menyelimutinya, setelah itu dikeringkan dalam oven suhu 60OC atau dijemur di bawah sinar matahari, setelah kering digiling dengan alat pen mill, dengan kehalusan 40 mesh (Lampiran 2). Sebelum dan sesudah delignifikasi dianalisis kadar air, lignin dan selulosa.

HIDROLISIS KIMIAWI  DAN FERMETASI ETANOL

Hidrolisis   secara   kimiawi   menggunakan   asam   sulfat   atau   asam  khlorida. Parameter yang dioptimasi adalah                                                                                jenis asam        (HCl/H2SO4) waktu hidrolisis, konsentrasi asam, dan TKKS yang terdelignifikasi atau tanpa delignifikasi. Pada hidrolisis dengan asam khlorida sebanyak 1 gram serbuk TKKS dimasukkan ke dalam tabung reaksi bertutup ulir, ditambahkan masing-masing 10 ml HCL 0,1 N; HCL 0,5 N; HCL 1N; dan HCL 2N, dihidrolisis menggunakan autoklaf suhu

121OC dengan waktu hidrolisis masing-masing 20 menit, 40 menit, 1 jam, 2 jam

dan 4 jam (Lampiran 3). Analisis gula pereduksi. Hidrolisis dengan asam sulfat prosesnya sama seperti tersebut diatas. Asam khlorida diganti dengan asam sulfat (Cowling, 1975). Analisis kadar gula pereduksi        yang terbentuk ( % terhadap

TKKS) dilakukan dengan Metode Dinitro Salisilic acid (DNS) (AOAC,   2005). Hidrolisis dioptimalkan dengan menaikkan suhu 200 C menggunakan H2SO4  2N dengan waktu hidrolisis 5; 7,5; 10; 12,5; dan 15 menit. Analisis kadar gula pereduksi. Berdasarkan hasil analisis gula pereduksi ( % terhadap TKKS ), hidrolisis optimum percobaan dilanjutkan dengan perbesaran skala 50 kali. Filtrat yang dihasilkan digunakan sebagai substrat untuk proses fermentasi selanjutnya (Xiang, 2003).

Fermentasi Etanol Hasil Hidrolisis Kimia Pada Kondisi Optimum

Sebelum  proses  fermentasi,  filtrat  hasil  dari  hidrolisis  dibuat  dalam  kondisi

overliming terlebih dahulu yaitu dengan menambahkan Ca(OH)2  hingga pH 12, dipanaskan dalam oven suhu 60o selama 20 jam, disaring, pH diturunkan kembali menjadi 5,0, lalu   disterilisasi (Millati et al. 2002). Proses fermentasi dilakukan sebagai berikut 1000 ml filtrat ditambah 10% (v/v) inokulum cair Saccharomyces

cerevisiae dengan waktu inkubasi 120 jam. Tiap 24 jam contoh disampling, kemudian dianalisis kadar gula pereduksi (metode DNS), pH (pH meter), etanol (metode hidrometer) dan volume  CO2.

HIDROLISIS ENZIMATIS DAN FERMENTASI ETANOL

Hidrolisis secara enzimatis dan fermentasi etanol dilakukan dengan metode simultan dan terpisah.

Metode Simultan:  Hidrolsis dan fermentasi dilakukan dengan cara menambahkan

100 gr TKKS terdelignifikasi  yang telah steril ke dalam media fermentasi (1000 ml). Setelah itu ditambahkan 5% isolat Trichoderma sp atau bakteri selulolitik asal  rayap  dan  10%  inokulum  cair  Saccharomyces  cerevisiae  (v/v).  Waktu inkubasi  5  hari  (120  jam)(Lampiran  4).  Tiap  24  jam  disampling                                                kemudian dianalisis kadar gula pereduksi, pH, etanol dan CO2 ( Ito et al. 2003 ).

Metode Terpisah: sebanyak 100 gr TKKS terdelignifikasi yang telah steril dimasukkan  ke  dalam  1000  ml  media  fermentasi,  ditambahkan  5%  isolat

Trichoderma  sp  atau  bakteri selulolitik,  kemudian  diinkubasi  selama  48  jam. Sampel diambil setiap 24 jam kemudian dianalisis kadar gula pereduksi, pH dan CO2.          Setelah  48                    jam      ditambahkan            10%        inokulum               cair               Saccharomyces cerevisiae(v/v) , inkubasi dilanjutkan hingga 120 jam (Lampiran 5). Setiap 24 jam disampling dan dianalisis gula pereduksi (metode DNS), etanol (metode hidrometer), pH (pH meter) dan volume CO2  (Spangler dan Emert, 1986 ).

ANALISIS

Analisis Bahan Baku dan Produk

Analisis Selulosa (TAPPI Method T203, Anom 1983)

Sebanyak 0,5 g serbuk TKKS dimasukkan ke dalam erlenmeyer 250 mL, ditambahkan 6 mL NaOCl, 1 mL asam asetat 10% dan 30 mL akuades, kemudian direfluks selama + 4 jam pada suhu 75 OC, dan setiap 2 jam ditambah 6 mL NaOCl, 1 mL asam asetat dan 25 mL akuades. Setelah 4 jam diangkat, disaring, divakum dan dicuci dengan akuades dingin dibilas dengan aseton dan eter dikeringkan dalam oven selama 3 jam, didinginkan dan ditimbang hingga bobot

tetap.

 

Holoselulosa (ASTM D-1102 s.d 1110).

Sebanyak 0,70 g (+ 0,05 g) serbuk bebas ekstraktif dimasukkan ke dalam erlenmeyer 250 ml. Kemudian ditambahkan 10 ml larutan A (60 ml HCI + 20 g NaOH, ditambah akuades hingga 1000 ml) dan secara hati-hati dimasukan pula 1 ml larutan B (200 g NaCIO 2    dalam 1000 ml akuades). Erlenmeyer dimasukan kedalam penangas air dengan suhu 70 + 2 0 C dan digoyang setiap 30 menit. Pada menit ke 45, 90, dan 150, ditambahkan 1 ml larutan B dan erlenmeyer digoyang- goyang setiap penambahan larutan B. Sesudah 4 jam erlenmeyer dimasukan ke dalam penangas air es dan ditambahkan 15 ml akuades es. Seluruh isi erlenmeyer disaring  menggunakan  cawan  saring  yang  sudah  diketahui  berat  kosongnya. Untuk membersihkan seluruh isi erlenmeyer, dilakukan pencucian dengan 100 ml larutan asam asetat 1%. Cawan saring dihisap dan dicuci dengan 2-5 ml aseton yang dibiarkan menetes keluar karena beratnya, kemudian dihisap lagi selama 3 menit. Selanjutnya cawan saring beserta isinya dikeringkan dalam tanur pada suhu 100-105 C dan timbang sampai beratnya konstan.